免疫组织化学(Immunocytochemistry, IHC) 是一门利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色的技术，能够对组织细胞内的抗原进行定位、定性及相对定量检测，进而深入探究其功能。

IHC实验步骤繁琐，包括切片制作（固定，脱水，透明，包埋，切片，贴片，烤片），脱蜡，水化，阻断，抗原修复，封闭，一抗孵育，二抗孵育，显色，复染，封片和分析等，每一个细节都可能影响到最终的染色结果。无论是从没做过IHC的实验小白，还是想要对当前方法进行优化的大牛，这篇秘籍都能让您有所收获。

切片制作

1.染色结果不理想，细胞核发灰模糊，对比不鲜明。

解决方法：①半小时内完成取材，组织离体后尽快固定；

②固定液选择视组织而定，有致密外膜用Carnoy液，活检用Bouin液，固定液体积要超过组织体积5倍以上，量少应中途换液1～3次；

③固定时间在4～24 h之间，长时间固定会影响抗原决定簇的暴露，且容易出现自发荧光及非特异性染色。

2.蜡块出现组织收缩凹陷，在抗原修复时脱片。

解决方法：①梯度酒精脱水尽量彻底充分；

②二甲苯脱蜡时间不宜长，1～3 h最佳，脱蜡过度会导致组织发硬发脆；

③浸蜡应选择低熔点的石蜡，并充分浸蜡；

④抗原修复时，高压时间过长，应适当缩短时间。

3.切片太厚，脱片，影响染色结果。

解决方法：①切片厚度视组织而定，如同淋巴结、肾等组织需要比较薄（不超过3 um），脑组织需要较厚（尤其是取新鲜标本冰冻制片时），6-8 um最佳，冰冻可切至10 um；其他一般如胃肠道、肝胆等等组织，2-4 um为宜，太厚易导致细胞重叠，影响观察；

②切片角度和刀片新旧程度对切片效果的影响较大，切片角度视切片机型号而异，新刀片更易切出完好的切片；

③捞片要求一步到位，轻夹轻放，达到无皱折、无气泡，水温控制在40℃左右；

④粘片时玻片可用多聚赖氨酸或蛋白甘油处理，或选择防脱片，以增强粘附性；

⑤烘干温度为50℃，时间为12～24 h。

4.染色不均匀。

解决方法：①切片厚度不一致，需更换刀片，调整切片机状态；

②试剂配制未混匀，导致局部浓度不一致，应将试剂充分混匀后滴加；

③在滴加试剂时让试剂完全覆盖组织；

④脱蜡不完全，可更换脱蜡剂或延长脱蜡时间。

5.切片边缘着色（边缘效应）。

解决方法：①组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽。玻片清洗干净后应用APES或多聚赖氨酸处理，并确保组织切片尽量薄，尽量避免选用坏死较多的组织；

②切片上滴加的试剂未覆盖均匀或未覆盖到全部组织，边缘的试剂少，容易变干，导致边缘的试剂浓度比中心区域的高，而使得染色结果偏深。滴加试剂时要均匀且充分覆盖到全部组织，为防止边缘水分减少，滴加试剂时可以适当超出组织边缘2 mm左右，保证组织部分覆盖均匀。用组化笔画圈时，距组织边缘3-4 mm为宜，避免油剂对实验结果的影响。

6.目标蛋白定位异常。

解决方法：①使用新鲜组织切片，

②固定不充分导致组织自溶，损坏，适当延长固定时间；

③根据组织大小，提高固定剂与组织的比例，切取小组织块，浸泡固定更加充分；

④固定剂使用不当，根据目标蛋白和样品组织性质选择不同固定剂；

⑤优化固定条件，包括浓度、温度、固定时间等；

⑥抗原扩散，尝试使用交联固定剂而不是有机（醇类）固定剂。

7.染色结果呈弱阳性。

解决方法：①不当的固定方式或固定时温度过高，影响待测抗原的数量和质量，应根据组织选择更适宜的固定方式及温度。

8.阳性检测率及着色强度相对减弱，甚至无染色。

解决方法：①固定液封闭了抗体识别表位，应缩短固定时间，增加抗原修复；

②靶蛋白含量低，建议增加抗体使用量或利用放大步骤来放大信号；

③靶蛋白为膜蛋白而表位可能因为渗透作用被破坏或移除，建议将缓冲液中的渗透试剂减少或移除。

④组织较厚，建议做细胞破膜，以便抗体顺利进入胞内与相应抗原结合。

抗原修复

1. 阳性检测率及着色强度相对减弱，甚至无染色。

解决方法：①抗原修复缓冲液有多种，常用的有柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0），EDTA缓冲液（pH 8.0-9.0），Tris / Tris-EDTA缓冲液（pH 9.0-10.0），和胰酶（pH 3.5±0.2），修复液的PH值对染色结果的影响比较大，具体选择应视情况而定；

②抗原修复不足，由于固定步骤引起的蛋白交联导致抗原仍未被修复会导致染色减弱，需使用正确的抗原修复方法，如微波热修复及高压热修复等；

③迅速冷却，加热结束后迅速用冷水浇淋使修复液急速降温，可能造成抗原暴露不充分，且降温太快，组织和载玻片的收缩系数不同易使组织脱片，应采用平缓冷却，即让修复液温度平缓下降的方式。

2.背景染色较深。

解决方法：①固定过度，需摸索修复条件，改变抗原修复方法或减小抗原修复强度；

②抗原修复过程中，切片干涸。修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，提高操作速度；

③避免切片在缓冲液或修复液中浸泡时间过长（大于 24 h）。

3.结果出现弱阳。

解决方法：①不适当的抗原修复方式，导致抗原决定簇暴露不足，需摸索修复条件，改变抗原修复方法。

4.目标蛋白定位异常。

解决方法：①抗原修复过强，导致组织结构被破坏，蛋白转移。应优化抗原修复程序或尝试不同的抗原修复方法，注意保留组织完整形态。